Chapter 7 —— 167 —— AAV-donorvectoren met een secundaire ouabaïne-selecteerbare donormodule en bijpassende gRNA-eenheden samengesteld en getest. Dergelijke AAV-ontwerpen, selector-AAV-vectoren genoemd, kunnen zorgen voor verrijking voor cellen die co-bewerkt zijn via een primaire doellocus en ATP1A1-allelen die resistentie verlenen tegen ouabaïne bij HDR-gemedieerde verwerving van specifieke polymorfismen. Belangrijk is dat naast verrijking voor gen-KI-celpopulaties, het combineren van selectorAAV-vectoren met ouabaïneselectie de eliminatie van HDR-onafhankelijke bewerkingen en off-target en/of willekeurige AAV-donor-DNA-inserties uit genoemde populaties veroorzaakte. Dit selector-AAV-principe werd succesvol toegepast voor het invoegen van hele transgenen op veilige havengenomische loci en voor het taggen van endogene eiwitten. Verder onthulden selector-AAV-vectortitratie-experimenten dat de hoogste verrijkingsfactoren van gen-gerichte cellen geassocieerd zijn met de laagste vector doses. Deze eigenschap zou gunstig kunnen zijn voor het verlichten van zowel AAVproductiekosten als schadelijke P53-afhankelijke DDR-activering. Opmerkelijk is dat het dubbele virale vectorplatform dat in hoofdstuk 4 wordt beschreven, werd gebruikt voor het stroomlijnen en uitbreiden van selector-AAV-vectortesten in moeilijk te transfecteren primaire cellen. Zoals besproken in Hoofdstuk 2 en Hoofdstuk 3, is er een groeiend besef dat, met name in DNA-schadegevoelige stamcellen, programmeerbare nuclease-geïnduceerde DSB's schadelijk zijn voor de stabiliteit van doelloci [22,23], en de levensvatbaarheid van cellen [7,19]. Het is veelzeggend dat Cas9D10A-nickases, vergeleken met Cas9-nucleasen, notoir minder mutageen zijn bij zowel on-target als off-target genomische sequenties, zoals bepaald door reporter en onbevooroordeelde genoombrede high-throughput-assays, respectievelijk [24,25]. Cas9D10A-nickases vertonen verder een sterk verminderde P53-afhankelijke DDR-activering wanneer ze naast hun Cas9nuclease-tegenhangers worden getest [9,26]. In deze context hebben transductie-experimenten beschreven in Hoofdstuk 5 aangetoond dat het combineren van een bepaald selector AAV-ontwerp, genaamd in-linkage
RkJQdWJsaXNoZXIy MTk4NDMw