Chapter 7 —— 163 —— NHEJ DNA-herstelpaden, canoniek of anderszins. Als gevolg hiervan is genome engineering met behulp van nickases dramatisch bevoordeeld ten opzichte van precieze HDR boven onnauwkeurige NHEJ-gebeurtenissen. Opmerkelijk is dat hoewel genomische SSB's op zichzelf zwakke HDRstimuli zijn, eerdere experimenten hebben aangetoond dat gelijktijdige SSBvorming bij acceptor-genoomsequenties en donor-DNA-substraten door CRISPR/Cas9-nickases HDR-gemedieerde gen-KI bevordert [7-9]. De toepassing van dit generieke in trans-paired nicking-principe levert genome engineering op van stamcellen met minimale indel vorming, translocaties en P53-afhankelijke activering van de DNA-schaderespons (DDR) waarvan bekend is dat deze apoptose veroorzaakt of de celcyclusprogressie stopt die nodig is voor HDR [7,9]. Daarom zullen, zoals aangegeven in Hoofdstuk 2, celtherapieproducten die zijn afgeleid van het gebruik van RNAprogrammeerbare nickases als zodanig of gekoppeld aan heterologe effectordomeinen, zoals prime editor reverse transcriptases of base editor deaminases, steeds vaker een complementaire set van 'zachte' genoombewerkingsopties gaan bieden waarvan de prestaties en veiligheidsprofielen mogelijk hoger zijn dan die voortvloeien uit het blootstellen van cellen aan programmeerbare nucleasen. In Hoofdstuk 3 wordt de relevantie van DSB-onafhankelijke genoombewerkingsinspanningen verder uitgewerkt door middel van een commentaar op een studie van Chai en collega's [10]. In deze studie worden base-editors op basis van Cas9-nickases die fuseren met deaminaseeffectordomeinen getest met als doel de dystrofinesynthese te herstellen in in vitro- en in vivo-modellen van Duchenne-spierdystrofie (DMD; MIM: 310200). In het bijzonder identificeren de auteurs adenine-base-editors en cognate guide-RNA's die, door A⋅T-naar-G⋅C-overgangen te installeren bij splicing-motieven, leiden tot DMD-leesraamreparatie via exon-skipping en daaropvolgende verwijdering van voortijdige stopcodons die ontstonden door out-of-frame-deleties. Door gebruik te maken van dubbele AAV-vectoren voor trans-splicing-assemblage van complete base-editor-eiwitten, tonen de
RkJQdWJsaXNoZXIy MTk4NDMw